碧芯生物助力生物實(shí)驗(yàn)—小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞（BMDCs）的獲得

樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cells, DCs）在天然識(shí)別病原體和隨后的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的活化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DCs通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子呈遞抗原肽來(lái)誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和分化，從而啟動(dòng)適應(yīng)性反應(yīng)。DC還可分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，增強(qiáng)并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。除了活化Naive T細(xì)胞的作用外，DCs被認(rèn)為在引導(dǎo)效應(yīng)性T細(xì)胞的分化以及T細(xì)胞耐受性的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。雖然DCs存在于體內(nèi)多種組織中，但含量很少，無(wú)法滿足科學(xué)研究和臨床治療的需要， 所以學(xué)者們嘗試多種方法來(lái)體外培養(yǎng)和擴(kuò)增DC。對(duì)于人DCs的獲得，常用的方法是從人外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMCs）誘導(dǎo)產(chǎn)生。而對(duì)于小鼠，最常見(jiàn)的方法是從骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生, 即骨髓來(lái)源的DC（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells, BMDCs）。

鑒于功能分析和分子生物學(xué)研究的需要，獲得更高數(shù)量和更高純度的BMDCs是大家一直追求的目標(biāo)。碧芯生物特邀海南醫(yī)學(xué)院的張老師與大家分享BMDCs的經(jīng)典制備方法(Lu, Zhang et al. 2021)，大家可根據(jù)自身需要選擇使用，因?yàn)樵噭┑钠放疲浱?hào)可能對(duì)BMDCs的制備質(zhì)量具有很大的影響，因此，我們列出了所用的所有試劑的品牌及貨號(hào),以供參考。

1.     試劑的準(zhǔn)備

1)   BMDCs培養(yǎng)基：取10 mL胎牛血清（Gibco，貨號(hào)：1932597），加入90 mL        RMPI 1640培養(yǎng)基（博士德，貨號(hào)：PYG0066），加入β-巰基乙醇               （Amresco，貨號(hào)：0482）使得終濃度為50 µM ，具體為取10 µL β-巰基乙醇        加入到1 mL PBS（博士德，貨號(hào)：PYG0021），混勻后再?gòu)闹腥〕?/span>34 µL，         加入至上述的100 mL培養(yǎng)基中即可。

2)  GM-CSF： GM-CSF是成功獲得BMDCs的關(guān)鍵試劑，我們實(shí)驗(yàn)室選用的abcam的小鼠重組GM-CSF（abcam貨號(hào)：ab9742），預(yù)先配制成2 µg/mL的溶液并分裝保存在-80 ^oC：取20 µg GM-CSF，先用 10 mL 含10% FBS（Gibco，Lot：193259）的RMPI 1640培養(yǎng)基（博士德，貨號(hào)：PYG0066）溶解，用無(wú)菌無(wú)內(nèi)毒素的1.5離心管分裝成每管100 µL，放置于-80 ^oC。

2.     獲得BMDCs

1)    取C57bl/6j小鼠一只，頸椎脫臼法處死，并在消毒酒精中浸泡2分鐘，在超凈工作臺(tái)中手術(shù)取出所有股骨和脛骨并剪刀和鑷子將骨周?chē)募∪饨M織盡量去除干凈，浸泡在2 mL PBS中（PBS置于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning，貨號(hào)：13418002 ）中的一孔）；將骨移入6孔板中的另一個(gè)盛有2 mL PBS的新孔中，用剪刀剪去骨兩端，再用注射器抽取PBS，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復(fù)沖洗出骨髓至培養(yǎng)皿中，直至骨*變白；收集骨髓懸液，并用45微米細(xì)胞過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾（Jet Biofil，貨號(hào)：CSS010040），收集細(xì)胞懸液，1000 g離心3分鐘，棄上清，往沉淀中加入1 mL紅細(xì)胞裂解液（Biosharp，貨號(hào)：69015473），輕輕吹打使細(xì)胞分散，1分鐘后1000 g離心3分鐘，棄上清，沉淀用PBS（博士德，貨號(hào)：PYG0021）洗滌一次，最終用2 mL BMDCs培養(yǎng)基分散，并將細(xì)胞分散液轉(zhuǎn)移至直徑為90 mm細(xì)菌培養(yǎng)皿（Nest，貨號(hào)：752001）中，再補(bǔ)入6 mL BMDCs培養(yǎng)基，加入80 µL預(yù)先配好的GM-CSF溶液(2 µg/mL)使終濃度至20 ng/mL，于二氧化碳培養(yǎng)箱（37 oC， 5% CO2）中培養(yǎng)48小時(shí)。

2)   48 h后，再加入8 mL BMDCs培養(yǎng)基以及 80 µL GM-CSF （2 µg/mL）,繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)；

3)   72 h后，換液，并加入80 µL GM-CSF (2 µg/mL)。 注意上清中的細(xì)胞不要丟棄。我們的做法如下：將上清轉(zhuǎn)移至15 mL無(wú)菌離心管中（Corning，貨號(hào)：15620023）,1000 g離心3分鐘，棄上清，細(xì)胞用8 mL BMDCs分散再加回至原細(xì)胞培養(yǎng)皿中，再加入GM-CSF 80 µL，在二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

4)    24 h后，取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，小心晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)皿使懸浮細(xì)胞分散均勻，取出含有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液離心（注意不要收集貼壁細(xì)胞），棄去上清，細(xì)胞用含有10%FBS的1640培養(yǎng)基（博士德，貨號(hào)：PYG0066）分散并測(cè)定細(xì)胞濃度，并接種在細(xì)胞培養(yǎng)板上，細(xì)胞培養(yǎng)板的尺寸根據(jù)個(gè)人實(shí)驗(yàn)確定。此時(shí)獲得的BMDC細(xì)胞為未成熟的DC細(xì)胞。

5)       加入LPS（Sigma， SMB00610）刺激24 h，我們就可以獲得成熟的BMDCs細(xì)胞。

圖1 BMDCs制備方法示意圖

3鑒定BMDCs

如何鑒定獲取了的BMDCs細(xì)胞并誘導(dǎo)了DC細(xì)胞的成熟呢？本實(shí)驗(yàn)室一般通過(guò)用熒光標(biāo)記的CD11c以及CD80、CD86染色，再用流式細(xì)胞技術(shù)，通過(guò)CD11c陽(yáng)性細(xì)胞的比例明確BMDCs的純度，通過(guò)CD80、CD86雙陽(yáng)的比例明確成熟BMDCs的比例。

此外，我們還通過(guò)對(duì)比無(wú)藥物刺激與LPS刺激BMDCs 24 h后，二者的細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1等細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化來(lái)確定BMDCs是否成功獲取以及成熟狀態(tài)。對(duì)于細(xì)胞因子檢測(cè)方面，要同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞上清中多個(gè)細(xì)胞因子的含量，采用ELISA工作量較大，且細(xì)胞上清有時(shí)可能不夠，因此使用碧芯生物科技有限公司的Beadstar-mPlex^TM小鼠多細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BS-MC01）可以滿足一次檢測(cè)多個(gè)細(xì)胞因子的需要。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)，只需要25 µL樣本，就可以同時(shí)檢測(cè)IL-6, TNF-ɑ，MCP-1等多個(gè)細(xì)胞因子的濃度。附圖為無(wú)藥物刺激與LPS刺激DC細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清液中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1的濃度（采用Beadstar-mPlex^TM多細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒測(cè)得）。

圖2. 無(wú)藥物刺激與LPS刺激BMDCs細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清液中IL-6, TNF-ɑ，MCP-1的濃度

參考文獻(xiàn)：

Lu, Z., Y. Zhang, et al. (2021). "A biotin-avidin-system-based virus-mimicking nanovaccine for tumor immunotherapy." Journal of Controlled Release 332: 245-259.